豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析

    摘要：我國多個(gè)省份的大規(guī)模養(yǎng)豬場都出現(xiàn)過新生仔豬神經(jīng)疾病和死亡的案例，為了確定是否豬偽狂犬病病毒的感染所致，本次研究選取我國多個(gè)省份的13個(gè)PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品，采用PCR方法對死亡仔豬腦組織中擴(kuò)增PRV的gE基因，進(jìn)行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實(shí)驗(yàn)及gE基因序列分析。將疑似PR病毒發(fā)病豬的腦部組織進(jìn)行勻漿，提取其DNA進(jìn)行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個(gè)豬場都存在病毒感染。結(jié)論：依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推測，當(dāng)下各個(gè)豬場流行的PRV病毒可能存在一定的抗原變異。

    在現(xiàn)代臨床研究治療中，由PR病毒所引起的豬急性傳染病就是豬偽狂犬病，PRV病毒會導(dǎo)致不同年齡段的豬被感染，其中又以哺乳豬仔和妊娠期母豬感染最為嚴(yán)重，致使哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹、神經(jīng)疾病、器官衰竭直至死亡，致使妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎，此類感染PRV病毒的死亡率達(dá)到100%。對于PRV病毒病，我國大型養(yǎng)豬場均采用PRV基因缺失疫苗進(jìn)行預(yù)防和治療，大體上取得了較好的效果。但是從2011年以來，很多采用PRV基因缺失疫苗進(jìn)行預(yù)防和治療的大型養(yǎng)豬場都出現(xiàn)了疑似PR病毒，臨床表現(xiàn)為母豬產(chǎn)死胎、弱仔，哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹、神經(jīng)疾病及死亡。本次研究選取我國多個(gè)省份的13個(gè)PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進(jìn)行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實(shí)驗(yàn)及gE基因序列分析，結(jié)果顯示，這些豬場所流行的PRV病毒擁有某種程度的抗原變異。

    1  資料與方法

   （1）臨床資料。選取我國多個(gè)省份的13個(gè)PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進(jìn)行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實(shí)驗(yàn)及gE基因序列分析，PRV經(jīng)典強(qiáng)毒雙城株和PRV疫苗株都在本院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保存。對來自我國河南、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、江蘇等多個(gè)省區(qū)的13個(gè)PR免疫豬場送檢的懷疑是PR的豬腦組織156份病毒樣品，選取適量豬腦組織進(jìn)行勻漿，依據(jù)臨床操作準(zhǔn)則，一部分勻漿液體用于病毒的分離鑒定，一部分用于提取病毒基因組的DNA進(jìn)行PCR 鑒定。

   （2）實(shí)驗(yàn)對象和細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)豬和小鼠購買自獸醫(yī)研究所，Vero細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保存。

   （3）引物的設(shè)計(jì)和合成。依據(jù)GenBank中所登記的PRV基因序列分別設(shè)計(jì)用來gE全基因擴(kuò)增和序列分析的引物和擴(kuò)增部分的gE基因的檢測引物。

   （4）病毒基因組的提取和PCR擴(kuò)增以及病毒的分離。病毒基因組的提取和PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)所描述的方法進(jìn)行臨床操作。病毒的分離是將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿，采用過濾器進(jìn)行過濾和除菌以后，取接種的Vero單層細(xì)胞，進(jìn)行孵化孕育1小時(shí)后，更換含有2%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液體，觀察細(xì)胞的病變，等待70%左右的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，進(jìn)行凍融一次以后，連續(xù)在Vero細(xì)胞中傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

   （5）電鏡觀察病毒粒子。選取Vero細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液體，采用2%的磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察病毒的粒子形態(tài)。

   （6）小鼠的感染實(shí)驗(yàn)。選取6～8周的55只小鼠，25只接種10×倍比稀釋的PRV-S強(qiáng)毒株，25只接種10×倍比稀釋的F5代分離株，經(jīng)過腹股溝皮下接種0.1mL，對另外5只小鼠注射等體積的DMEM培養(yǎng)液體來作為陰性對照。觀察小鼠的臨床癥狀和死亡狀況，依據(jù)Reed Muench方法進(jìn)行計(jì)算其LD50。

   （7）病毒的中和實(shí)驗(yàn)。對新分離的病毒接種豬血清和疫苗株Bartha k61接種豬血清，采用固定病毒稀釋血清方法測定兩株病毒的中和抗體。

    2  結(jié)果

    病毒資料檢測。將疑似PR病毒的發(fā)病豬的腦部組織進(jìn)行勻漿，提取其DNA進(jìn)行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個(gè)豬場都存在病毒感染。病毒的分離及鑒定。將少部分豬腦腦組織勻漿液體過濾除菌接種Vero細(xì)胞，48小時(shí)可以觀察到網(wǎng)狀的細(xì)胞病變。進(jìn)行PCR鑒定，可以擴(kuò)增到預(yù)期的大小片段，采用豬圓環(huán)病毒、豬繁殖、豬瘟和呼吸綜合征病毒特異性物擴(kuò)增，都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。電鏡檢測，觀察到病毒的粒子呈圓形，臨床體征有實(shí)心和中心，分為沒有囊膜和有囊膜兩種。gE基因序列的分析。最近分離的PRV都處于相對獨(dú)立的分支中，和以往分離的病毒株親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。

    小鼠的感染實(shí)驗(yàn)。小鼠接種的PRV-S強(qiáng)毒株和F5代分離株都出現(xiàn)了PR臨床癥狀，發(fā)病白鼠撕咬接種的部位，致使局部皮膚出血、皮毛脫落、撕咬肢體，病毒接種量達(dá)到103.0～106.0的TCID50的小鼠72小時(shí)后死亡，F(xiàn)5代分離株小鼠的LD50為103.37TCID50，PRV-S小鼠的LD50為103.83TCID50，注射DMEM培養(yǎng)液體的對照組小鼠沒有臨床癥狀。

    血清交叉中和實(shí)驗(yàn)。疫苗株Bartha k61接種豬血清產(chǎn)生的中和抗體水平和病毒接種豬血清相比比較低，可以50%中和自身病毒的血清稀釋度都在1∶20～1∶40。對于分離病毒接種豬血清的中和能力更加低，分離病毒接種豬感染2周就可以產(chǎn)生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度都在1∶80以上，對兩種病毒的中和能力都比較。

    3  討論

    危害養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重傳染病就包括豬偽狂犬病，對豬偽狂犬病的預(yù)防主要依靠基因缺失疫苗的接種。采用微量中和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)進(jìn)行分析，Barthak61接種豬血清所產(chǎn)生的中和病毒接種豬血清產(chǎn)生的中和抗體水平比較低，對新分離的病毒接種豬血清產(chǎn)生的抗體水平較高，表明PR當(dāng)下流行的病毒株和疫苗株之間在抗原性上存在一定的差異。

   （陜西省涇陽縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所  屈鋒；陜西省榆林市榆陽區(qū)青云鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站  王敏杰）